Microscopía de rayos X

Un microscopio de rayos X se utiliza para producir imágenes magnificadas de una muestra iluminada con rayos X. Existen dos tipos básicos de microscopio: los microscopios de imagen, que toman imágenes de todo el campo de visión a la vez, y los microscopios de barrido, que barren el campo de visión punto por punto. El campo de imagen se refiere a la zona de la muestra analizada que es visualizada por el microscopio. En los microscopios de imagen, el campo de imagen completamente iluminado se visualiza simultáneamente en el detector, que consta de muchos píxeles. En los microscopios de barrido, un punto de iluminación brillante y bien enfocado ilumina el campo de la imagen en un solo punto cada vez, que se desplaza por la superficie siguiendo un patrón de cuadrícula. El detector registra la intensidad total procedente del punto de muestra iluminado. La imagen se calcula a partir de las intensidades medidas de este modo una vez escaneada toda la muestra.

¿Cuáles son las ventajas de un microscopio de rayos X frente a otros tipos de microscopio?

Los rayos X penetran más profundamente en la materia que la luz visible. Esto permite a los microscopios de rayos X obtener imágenes del interior de muestras opacas a la luz visible.

Los microscopios de rayos X pueden alcanzar una mayor resolución óptica que los microscopios para luz visible (normalmente denominados «microscopios ópticos»). La longitud de onda de los rayos X es considerablemente más corta que la de la luz visible. Como resultado, el límite físico de la resolución que se puede alcanzar con los microscopios de rayos X debido a la difracción es significativamente mayor que la resolución que se puede alcanzar con los microscopios ópticos. En comparación, los microscopios electrónicos de barrido tienen una resolución aún mayor, pero para ello las muestras deben ser estancas al vacío y tener una superficie metálica conductora. Los organismos vivos, por ejemplo, no pueden visualizarse con este método. Los microscopios electrónicos de barrido sólo captan la superficie de una muestra o, en el caso de los microscopios electrónicos de barrido de transmisión, la vista a través de una capa muy fina. En la Tabla 1 se comparan algunas de las propiedades de los distintos microscopios.

Table 1: Comparación de diferentes tipos de microscopios (valores sólo para orientación)

Los microscopios de rayos X de formación de imágenes son microscopios de magnificación por proyección de sombras (figura 1) o microscopios con elementos ópticos de enfoque (figura 2).

Microscopios de magnificación de proyección de sombras

constan de una fuente de rayos X 1 lo más puntiforme posible o de un sistema óptico 4 que genera una imagen miniaturizada 5 de una fuente 1, la muestra 2 situada cerca de la fuente 1 (o cerca de la imagen 5 de la fuente), un detector que registra la imagen 3 de la muestra (Fig. 1) y un banco óptico para alinear los componentes. En la forma más sencilla de este tipo de microscopio no es necesario influir en la dirección de los rayos X.

El aumento en esta configuración es el cociente L₂ / L₁ con el L₁ y la distancia fuente-imagen L₂. La resolución óptica alcanzable depende principalmente del diámetro de la fuente D_Source, ya que las medias sombras aumentan con una fuente más grande y dan lugar a imágenes borrosas. Con este tipo de microscopio se pueden resolver dos puntos de muestra a una distancia mínima de aproximadamente D_Source. Este límite puede desplazarse por delante de la muestra mediante la óptica de enfoque 4. La óptica genera una imagen reducida de la fuente, que sirve entonces como fuente para la proyección de sombras. Físicamente, la resolución máxima alcanzable también está limitada aquí por la difracción.

Fig. 1: Microscopios de proyección de sombras: con una fuente 1 pequeña (izquierda) y con generación de una imagen 5 reducida de la fuente 1 (por ejemplo, con ayuda de una placa de zona Fresnel) para obtener imágenes más nítidas (derecha).

Microscopios con elementos ópticos de enfoque

constan de una fuente de rayos X, eventualmente una óptica de iluminación, una muestra de una óptica de imagen, un detector de imagen y un banco óptico para alinear los componentes.

La fuente puede ser un tubo de rayos X, una fuente de sincrotrón o una fuente de plasma. La intensidad de la fuente determina el tiempo de exposición necesario para capturar una imagen con una buena relación señal/ruido. Dependiendo del tipo de microscopio, la distribución espectral de las energías de los fotones debe coincidir con las propiedades ópticas del microscopio. En la mayoría de los casos, es necesario restringir el rango de energía de los fotones a un rango pequeño para que el sistema global funcione bien.

La óptica de iluminación se utiliza para llevar el mayor número posible de fotones a la muestra con el fin de lograr tiempos de exposición cortos. En la mayoría de los casos, debe iluminarse homogéneamente una zona rectangular de la muestra. La óptica de iluminación debe ser adecuada para concentrar el espectro de fotones deseado sobre la muestra. Además, cada punto de la muestra debe iluminarse en determinados ángulos para conseguir una buena calidad de imagen del microscopio.

La muestra se fija en un portamuestras. Este portamuestras (o la mesa sobre la que se encuentra) suele poder motorizarse para colocar la muestra con precisión en el haz de rayos X. Esto permite seleccionar el área de imagen deseada, enfocar la imagen y, en algunos casos, ajustar el aumento. Esto permite seleccionar el área de imagen deseada, enfocar la imagen y, en algunos casos, ajustar el aumento.

La óptica de imagen se coloca a una distancia de la muestra superior a su distancia focal (e inferior al doble de su distancia focal en el caso de una imagen de aumento). Se asigna cada punto de la muestra dentro del campo de la imagen al punto correspondiente en el plano de la imagen. La óptica de formación de imágenes debe ser adecuada para la energía fonónica utilizada y su ángulo de aceptación de entrada debe ser lo suficientemente grande para formar la imagen del campo de visión deseado.

El detector de rayos X se utiliza para convertir la distribución de la intensidad de los rayos X en el plano de la imagen en una imagen visible o en señales eléctricas que se muestran como imagen en un monitor de ordenador. Por tanto, el detector puede ser una película fotográfica, un detector de panel plano o un cristal centelleador (que convierte los rayos X en luz visible) en combinación con una cámara CCD que registra la luz visible.

Para lograr una alta resolución óptica es necesario un banco óptico rígido en el que los componentes ópticos estén alineados entre sí.

Fig. 2: Esquema de un ejemplo de montaje de un microscopio de rayos X duros de campo completo, en este ejemplo utilizando sólo lentes de rayos X refractivos ©01

Los microscopios de barrido de rayos X constan de una fuente de rayos X, un sistema óptico que genera un punto focal intenso y minimizado sobre la muestra, un portamuestras que genera el movimiento de barrido, un detector que mide el flujo de fotones incidente y un banco óptico en el que se alinean los componentes ópticos.

La fuente y el banco óptico tienen las mismas funciones que los componentes correspondientes de un microscopio de imagen.

El punto focal sobre la muestra puede generarse mediante una óptica capilar, una placa de zona de Frenel, una lente de rayos X refractiva o una óptica de espejo, por ejemplo. Sobre todo, la óptica utilizada debe llevar el mayor número posible de fotones al punto focal más pequeño posible sobre la muestra. Si la muestra es relativamente gruesa, la óptica debe generar un haz focalizado con la cintura del haz más larga posible. Si la cintura del haz con su forma de doble cono es muy corta, la calidad de la imagen se reduce.

La platina con el portamuestras desplaza la muestra a través del haz en forma de meandros hasta que se explora línea por línea todo el campo de imagen. El tamaño de paso necesario depende de la resolución de imagen deseada. A título orientativo, el tamaño del paso debería corresponder aproximadamente a la mitad del diámetro del punto focal para conseguir la mejor calidad de imagen posible. La posición de la platina debe conocerse durante toda la exposición con una precisión superior al tamaño del paso para poder reconstruir posteriormente la imagen a partir de las intensidades medidas localmente.

Con este tipo de microscopio de rayos X se puede utilizar un detector de rayos X que no necesite resolución espacial, por ejemplo, un diodo pin o un detector de centelleo. Esto supone una ventaja con respecto a los microscopios de rayos X de formación de imágenes, ya que éstos requieren costosos detectores de resolución espacial y bajo ruido.

Fig. 3: Esquema de un ejemplo de montaje de un microscopio de rayos X de barrido, en este ejemplo utilizando una placa de zona Fresnel (con sus necesarias aberturas de clasificación por orden).